小鼠免疫球蛋白E(IgE)作為免疫反應中的重要組成部分，在多種生物學研究和臨床應用中具有舉足輕重的地位。小鼠IgE試劑盒，特別是基于酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)技術的試劑盒，已成為定量檢測小鼠血清、血漿及相關生物樣本中IgE含量的重要工具。本文將詳細介紹該試劑盒的操作步驟及需要注意的關鍵事項，幫助研究人員和實驗室技術人員更好地使用這一工具。
 

　　一、操作步驟
 

　　1、準備階段
 

　　1.1 試劑復溫：從冰箱取出試劑盒，室溫下復溫平衡約30分鐘，確保各組分達到適宜的檢測溫度。
 

　　1.2 洗滌液配制：用蒸餾水將試劑盒中提供的濃縮洗滌液稀釋至工作濃度。通常，按照1:20的比例進行稀釋，即每份濃縮洗滌液加入19份純水。
 

　　2、樣品與標準品準備
 

　　2.1 加樣：在酶標包被板上設置標準品孔、待測樣本孔和空白對照孔。標準品孔中依次加入不同濃度的標準品各50μl，待測樣本孔中先加入樣本稀釋液40μl，再加入待測樣本10μl(最終稀釋度為5倍)?？瞻讓φ湛撞患尤魏卧噭?。
 

　　2.2溫育：用封板膜封板后，置于37℃溫育30分鐘，使樣本中的IgE與包被在板上的抗體充分結(jié)合。
 

　　3、洗滌與加酶
 

　　3.1 洗滌：溫育結(jié)束后，小心揭掉封板膜，棄去孔內(nèi)液體，并在吸水紙上拍干。隨后，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，重復洗滌4次(或使用洗板機進行自動化洗滌)，確保去除未結(jié)合的成分。
 

　　3.2 加酶：每孔加入酶標試劑50μl(空白對照孔除外)，再次封板后置于37℃溫育30分鐘，使酶標抗體與已結(jié)合的IgE形成復合物。
 

　　4、顯色與終止
 

　　4.1 顯色：溫育結(jié)束后，每孔先加入顯色劑A液50μl，再加入顯色劑B液50μl，輕輕震蕩混勻，置于37℃避光顯色15分鐘。在此過程中，底物在辣根過氧化物酶(HRP)的催化下轉(zhuǎn)化為藍色產(chǎn)物，隨后在酸的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色。
 

　　4.2終止：每孔加入終止液50μl，終止顯色反應(此時顏色由藍色立即轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色)。
 

　　5、 結(jié)果測定
 

　　5.1 吸光度測定：在終止反應后15分鐘內(nèi)，使用酶標儀在450nm波長下測定各孔的吸光度(OD值)。以空白孔調(diào)零，記錄并保存數(shù)據(jù)。
 

　　5.2 濃度計算：根據(jù)標準品的濃度及其對應的OD值，繪制標準曲線，并計算回歸方程。根據(jù)待測樣本的OD值，在回歸方程上計算出對應的IgE濃度。由于樣本進行了5倍稀釋，因此最終濃度需乘以5。
 

　　二、注意事項
 

　　1. 樣本處理：樣本采集后應盡早進行提取，并按相關文獻進行操作。避免使用含NaN3的樣本，因為NaN3會抑制HRP的活性。
 

　　2. 操作規(guī)范：實驗過程中應嚴格遵守說明書操作，確保每一步驟的準確性和重復性。所有標準品、樣本和空白對照都應做雙份檢測，以減小實驗誤差。
 

　　3. 交叉污染：為避免交叉污染，每加一個樣本或試劑就應更換一次吸頭。酶標工作液、樣本稀釋液和底物等公共組分應懸臂加樣，不得碰到微孔。
 

　　4. 試劑保存：試劑盒應在2-8℃條件下避光保存，不同批號的試劑不得混用。未開封的酶標包被板應裝入密封袋中加干燥劑保存。
 

　　5. 結(jié)果解讀：實驗結(jié)果的判定應以酶標儀讀數(shù)為準，避免主觀判斷。若顯色過淺，可適當延長底物溫育時間，但需注意控制時間以避免背景過高。
 

　　綜上所述，小鼠IgE試劑盒在操作過程中需細致入微，從試劑復溫、樣本處理到結(jié)果測定，每一步都需嚴格按照說明書執(zhí)行。只有這樣，才能確保實驗結(jié)果的準確性和可靠性，為科學研究提供有力的數(shù)據(jù)支持。